עם היווסדה של מפא"י עמד בראשה דוד בן-גוריון ולצידו ברל כצנלסון וחיים ארלוזורוב. מעמדו הדומיננטי של בן-גוריון במפלגה נמשך עד לשנות ה-60. פרשת לבון, אשר נחשפה בשנת 1960, הביאה למשבר ולפילוג שהביא עמו את פרישתו של בן-גוריון מן המפלגה שייסד. במהלך הפרשה הסתבר כי כוחה של המפלגה, והאהדה לה זכתה בציבור הבוחרים הישראלי (ויש אומרים, הקשרים הכלכליים, בהם הצליחה המפלגה לקשור אליה בוחרים רבים) היו חזקים מהאהדה שרחשו לבן-גוריון. חזרתם של פורשי רשימת בן-גוריון רפ"י מסמנת את סופה של מפא"י, והפיכתה למסגרת ארגונית חדשה - מפלגת העבודה הישראלית - אשר יש הרואים בה את ממשיכתה של מפא"י מבחינה ארגונית ואידאולוגית.

מפא"י ייצגה את הזרם השלטוני המרכזי ביישוב ובמדינת ישראל. היא הייתה מזוהה עם הציונות המעשית ועם ההתיישבות העובדת, ניווטה את היישוב העברי בארץ ישראל לקראת הקמת המדינה, עמדה בראש מוסדותיו הרשמיים והבלתי רשמיים, כגון הסוכנות היהודית לארץ ישראל וההסתדרות. לאחר הקמת המדינה הייתה למפלגת השלטון היחידה, ושלטה ללא עוררין במדינה במשך כשלושה עשורים. במשך יותר מ-30 שנה (מתוך מעל 45 שנה רצופות, בהן הנהיגה המפלגה את התנועה הציונית, היישוב והמדינה) עמד בראשה דוד בן-גוריון. בשנת 1968 התאחדה מפא"י עם מפלגות שהיו חלק ממנה בעבר: אחדות העבודה - פועלי ציון (צאצאית של התנועה לאחדות העבודה שפרשה ממפא"י) ורפ"י (שפרשה אף היא ממפא"י), ליצירת "מפלגת העבודה הישראלית".