תריודוטירונין נוצר בשני מסלולים מקבילים. האחד מתחיל בחלל הזקיק של בלוטת התריס מצימוד של מונויודוטירוזין ודיודוטירוזין על גבי החלבון תירוגלובולין. כאשר תירוגלובולין נכנס חלל הזקיק חזרה אל תא הזקיק, מפורק ממנו תריודוטירונין בליזוזום. תריודוטירונין הוא מולקולה הידרופובית ויציאתה לזרם הדם אינה מתווכת. בזרם הדם נקשר תריודוטירונין לחלבונים הקושרים הורמוני בלוטת התריס כגלובולין קושר תירוקסין וכטרנסתירטין. בנוסף הוא נקשר גם לאלבומין. ישנו גם שיעור קטן של הורמונים אשר חופשי בדם, וזה אותו שיעור שבסופו של דבר משקף פעילות ביולוגית, משום שהוא זה שיכול להיכנס לתאים. לתאים ההורמון נכנס דרך נשא של הורמוני תריס. המסלול השני הוא בתוך תאי המטרה של הורמון בלוטת התריס, שם תירוקסין, אשר עבר את המסלול שפורט לעיל עבור תריודוטירונין, עובר דה-יודינציה על ידי אנזים דה-יודינאז לתריודוטירונין.

בתא המטרה תריודוטירונין חודר לגרעין התא ושם משפיע על רמת השעתוק של גנים שונים, בין אם בהגברה או בעיכוב. לתריודוטירונין אפיניות גבוהה יותר מתירוקסין לקולטנים, והוא ההורמון הפעיל יותר ביולוגית. הדבר גם מאפשר בקרה נוספת על רמת ההורמון, שכן רוב הורמון התריס המופרש מהבלוטה הוא בצורת תירוקסין. תריודוטירונין מגביר בתא את הייצור של ATPase ובכך את הניצול של ATP במטבוליזם. הדבר משחרר אנרגיה, שחלקה משתחררת בתור חום, ולכן הורמון זה מעלה חום גוף. פירוק ה-ATP דורש פיצוי בצורת צריכת חמצן מוגברת. העלייה בחום הגוף גוררת עלייה בזרימת הדם ההיקפית, דופק מואץ והזעה במטרה להיפטר מעודף החום. הגברת קצב המטבוליזם גם גורמת לירידה במשקל, למרות העלייה בתיאבון שכן הניצול הקלורי בחילוף החומרים עולה על צריכת הקלוריות במזון. כמו כן, ההורמון מעודד את השעתוק של הורמון גדילה.